Existen estudios dirigidos hacia la composición y cuantificación de la microflora responsable de las fermentaciones espontáneas. Dentro de ellos se ha encontrado que las levaduras son microorganismos clave durante la fermentación alcohólica. En el presente estudio se aislaron y caracterizaron molecularmente dos levaduras por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) en las cuales se comparan los patrones de restricción de diferentes regiones genómicas correspondientes al DNA ribosomal. Se realizó un diseño de experimentos (DE) basado en la metodología de superficie de respuesta (MSR) para diseñar un medio de cultivo en la producción de Mezcal, usando como sustrato jugo de Agave cupreata y la levadura LEVM. Encontrándose por RFLP dos levaduras Saccharomyces cerevisiae (LEVM y LEVZ). En el DE para la LEVM las variables analizadas fueron el pH, concentración de sustrato y temperatura, para evaluar las variables y los niveles de operación lo más cercanos posible al proceso original. Encontrando que la temperatura es la variable que tiene un efecto significativo sobre la producción de etanol., estos resultados preliminares muestran la importancia de usar técnicas moleculares para la caracterización de levaduras en la industria de las bebidas y el uso de DE permitió establecer las condiciones para llevar a cabo el proceso de fermentación.